INFO

Association Tourangelle des Internes et Chefs de clinique d'ORL

Menu Principal

Identification



Actuellement en ligne

Nous avons 5 invités en ligne
mod_vvisit_counterAujourd'hui58
mod_vvisit_counterCette semaine311
mod_vvisit_counterToujours331451
Accueil >> DES d'ORL >> Autres cours >> Matériel et méthodes de l'histologie médicale
Matériel et méthodes de l'histologie médicale


Toute activité histologique a en commun l'action de voir (observer) et d'interpréter ce qui est vu. Dans toute démarche d'ordre histologique, 4 étapes se succèdent : 1) le choix du matériel à étudier, 2) la technique permettant de visualiser les structures ou les phénomènes que l'on veut étudier, 3) la production d'images de ces structures ou de ces phénomènes, par des moyens optiques, 4) l'interprétation de ces images.

L'histologie moléculaire a pour but de visualiser in situ - dans les tissus, les cellules, leurs organites ou la matrice extra-cellulaire (MEC) - des molécules (en particulier les gènes, leurs ARN-messagers et les protéines pour lesquelles ils codent), en déterminant leur situation et leur configuration. L'histologie moléculaire permet donc de décrire la morphologie cellulaire et tissulaire en termes d'architecture et d'interactions moléculaires.


Le choix du matériel et les modalités de prélèvement


Les méthodes utilisées en histologie varient selon le matériel (échantillons ou specimens) à étudier et les objectifs de l'examen (diagnostic histopathologique chez l'homme ou chez l'animal, ou protocole de recherche).


.1.1 L'observation peut porter sur des préparations où les cellules restent entières

  • Des cellules vivantes peuvent être observées entre lame et lamelle afin d'évaluer certaines de leurs fonctions (par exemple, mobilité des spermatozoïdes, mesure de la fréquence du battement des cellules ciliées, chimiotactisme des granulocytes neutrophiles). L'examen microscopique est parfois effectué après adjonction de colorants vitaux qui permettent d'évaluer la viabilité cellulaire (bleu trypan, nigrosine qui pénètrent dans les cellules mortes), ou de mettre en évidence des structures (rouge neutre visualisant les vacuoles de pinocytose).

Les analyses peuvent être réalisées à partir de fragments d'organe ou de cellules dissociées par action enzymatique, cultivées en suspension ou sur un support auquel elles adhèrent. Ces techniques sont largement utilisées en recherche mais aussi en diagnostic : ainsi, par exemple, les caryotypes sont habituellement réalisés sur des cultures de lymphocytes sanguins ou de cellules du liquide amniotique.


Des cellules entières fixées peuvent être examinées sur des frottis (étalement de cellules sur une lame de verre) pour l'étude des cellules sanguines et de celles de différents liquides de l'organisme (comme, par exemple, le liquide cérébrospinal, du liquide articulaire, du liquide d'épanchement pleural, du liquide d'ascite) ou sur des empreintes (cellules provenant d'un fragment d'organe - un ganglion lymphatique par exemple - apposées sur une lame). Ces techniques peuvent être utilisées pour rechercher des cellules tumorales, comme c'est le cas pour les frottis cervico-vaginaux de dépistage des cancers du col de l'utérus.


1.2 Le plus souvent, le matériel est fixé, inclus, coupé et coloré

Les cellules, associées dans des tissus, sont coupées afin de pouvoir les observer au microscope. Il s'agit d'observer au microscope optique (MO) ou électronique (ME) des cellules, tissus, organes ou fragments d'organe, voire des organismes entiers (embryons de souris par exemple) qu'une préparation technique plus ou moins compliquée aura rendues suffisamment minces et transparents pour être observés et suffisamment contrastés pour y reconnaître les divers éléments constitutifs. On peut distinguer l'étude des cellules isolées (« cytologie ») et celles des coupes de tissus ou d'organes (« histologie »). Les examens histologiques sont en règle réalisés après traitement du matériel par des agents physiques ou chimiques (fixateurs) qui tuent les cellules mais visent à préserver au maximum leurs caractéristiques morphologiques et biochimiques.

  • Le matériel est prélevé de différentes façons. Le matériel histologique peut être obtenu par biopsieponction à l'aiguille (comme pour les liquides pleural, péritonéal, articulaire, pour les ganglions, les seins, la moelle osseuse). Le matériel histologique peut aussi provenir d'une pièce opératoire, d'une autopsie ou de la dissection d'organe en expérimentation animale. (directe comme pour la peau, le muscle ou avec endoscopie pour les organes des appareils respiratoire, digestif, urinaire), par

La microdissection permet d'intervenir sur un seul type cellulaire. L'utilisation de systèmes de microdissection utilisant un faisceau laser permet de recueillir des cellules dont les protéines, les ARN et l'ADN sont intacts et susceptibles d'être analysés à l'échelle d'une population cellulaire pure (par exemple constitution de banque d'ADN complémentaires, étude de l'expression des gènes).


1.3 Avant le prélèvement, des protocoles expérimentaux plus ou moins sophistiqués sont parfois mis en œuvre

On peut utiliser des procédés classiques comme les excisions, les greffes, les traçages cellulaires. On peut également faire appel à des manipulations génétiques. Les organismes les plus utilisés pour des manipulations génétiques sont les plantes, le ver nématode Caenorhabditis Elegans, la mouche Drosophile et la souris. Les deux méthodes les plus employées pour analyser la fonction d'un gène in vivo sont : 1) la surexpression de ce gène (souris transgéniques créées par injection directe du gène d'intérêt dans un oeuf fécondé), 2) l'invalidation de ce gène (souris « knockout »).


2 - Les techniques de MO et de ME sont utilisées en routine pour visualiser les structures

Pour rendre visible ce que l'on veut observer, il est nécessaire de mettre en oeuvre des techniques diverses (préparation des échantillons) que l'on applique au matériel. Pour l'observation en MO ou en ME, les coupes examinées sont le fruit de procédures techniques qui requièrent plusieurs étapes successives : fixation, inclusion, coupe, coloration, montage.


1 Pour la MO : fixation au formol, inclusion en paraffine, colorations standard (hématéine-éosine ou trichrome)

La fixation a pour but la conservation des structures et le durcissement des pièces. Elle doit se faire immédiatement après le prélèvement, par immersion du matériel dans un grand volume de liquide fixateur. Les liquides fixateurs les plus utilisés sont le formol ou le liquide de Bouin (mélange de formol et d'acide picrique). La durée de la fixation varie selon le volume des prélèvements (de quelques heures pour un petit fragment biopsique à plusieurs semaines pour un cerveau humain entier).

L'inclusion a pour but de permettre la réalisation de coupes fines et régulières. Le milieu d'inclusion le plus utilisé est la paraffine. Comme la paraffine est hydrophobe, le prélèvement doit d'abord subir une déshydratation (par immersion dans des bains d'alcool de degré croissant puis dans des bains de toluène) avant d'être coulé dans un moule contenant de la paraffine fondue par chauffage et devenue liquide, qui infiltre alors toute la pièce. Après refroidissement, on se trouve en présence d'un bloc de paraffine, dur, à l'intérieur duquel la pièce prélevée est incluse. Dans certains cas, on utilise d'autres milieux d'inclusion (celloïdine, résines plastiques, etc.).

Les coupes du bloc de paraffine sont faites avec un microtome permettant de réaliser des tranches de section (coupes) de 2 à 5 µm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies sur des lames de verre.

Les colorations réalisées sur lames, accentuent les contrastes pour mieux reconnaître les différents éléments de la préparation. Comme les colorants sont en solution aqueuse, les coupes doivent d'abord subir une réhydratation. Celle-ci est effectuée après déparaffinage des coupes (par la chaleur et des bains de toluène) en immergeant les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant puis dans l'eau distillée. Les colorations les plus fréquemment utilisées associent deux ou trois colorants différents : l'Hématéine-Eosine (H.E.) associe l'hématéine qui colore les noyaux en violet et l'éosine les cytoplasmes en rose ; les colorations trichromiques usuelles sont l'Hématéine-Eosine-Safran (H.E.S.) par ajout de safran colorant en jaune les fibres de collagène, et le trichrome de Masson qui associe un colorant nucléaire (hématoxyline), un colorant cytoplasmique et un colorant bleu ou vert colorant les fibres de collagène. De nombreuses colorations spéciales (dites signalétiques) permettent de visualiser différentes structures ou composants des tissus (par exemple, les fibres de réticuline par des colorations argentiques ou les fibres élastiques par l'orcéine).

Le montage. Après avoir subi une déshydratation (par bains d'alcool de degré croissant puis bains de toluène), les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle avec une résine synthétique dont l'indice de réfraction est voisin de celui du verre. On dispose alors d'une « préparation microscopique » (simplement appelée « lame » dans le langage courant) prête à être observée au MO.


2.2 Pour la ME : fixation à la glutaraldéhyde, post-fixation à l'acide osmique, inclusion en épon, contraste par l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb

La technique dite « standard » de ME est analogue dans ses principes à celle de MO, mais les modalités précises diffèrent.

La fixation se fait habituellement dans de la glutaraldéhyde tamponnée et est suivie d'une post-fixation à l'acide osmique.

L'inclusion se fait dans une résine synthétique type Epon ou Araldite, après que les fragments ont été déshydratés dans les alcools et dans l'oxyde de propylène.

Les coupes ultrafines des blocs sont réalisées grâce à un ultramicrotome qui permet d'obtenir des coupes ultrafines d'environ 80 nm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies sur des grilles de cuivre. Avec le même ultramicrotome, on peut faire des coupes semi-fines, observables en MO et permettant de guider le choix des zones à étudier en ME.

Le contraste des coupes s'effectue habituellement avec de l'acétate d'uranyle (contrastant les nucléoprotéines : noyau, nucléole, ribosomes) et des sels de plomb comme le citrate de plomb (contrastant les membranes).


3.1 L'histochimie

Les techniques histochimiques sont basées sur des réactions biochimiques qui permettent de mettre en évidence in situ, dans les cellules ou dans les tissus, différents constituants (lipides, glucides, protéines, acides nucléiques, métaux, etc).

3.2 L'histoenzymologie

La présence d'enzymes (phosphatases, par exemple) peut être décelée par leur action sur un substrat fourni au cours de la technique histoenzymologique, permettant d'obtenir un produit secondairement révélé par coloration.


3.3 L'immunohistochimie

L'immunohistochimie (ou immunocytochimie) consiste à détecter dans les tissus ou les cellules, le site de la liaison d'un anticorps spécifique avec la protéine contre laquelle il est dirigé.

Les anticorps spécifiques sont polyclonaux ou monoclonaux

Les anticorps spécifiques peuvent être fabriqués en injectant à plusieurs reprises un échantillon de l'antigène (protéine à détecter) à un animal (le plus souvent, lapin ou chèvre), et en recueillant ensuite le sérum riche en anticorps (antisérum). Cet antisérum contient différents anticorps dits polyclonaux, produits par différents plasmocytes, reconnaissant divers antigènes de la protéine d'intérêt.

Un anticorps monoclonal correspond à une population d'anticorps identiques dirigés contre le même site antigénique d'une protéine. Ces anticorps sont produits en grande quantité en culture par un clone de lymphocytes B selon la technique des hybridomes. Après avoir immunisé une souris contre un antigène donné, on prélève dans sa rate des lymphocytes B. Ceux-ci sont fusionnés avec des plasmocytes tumoraux immortalisés. Après sélection, les hybridomes ainsi obtenus sont une source permanente et stable d'un seul type d'anticorps monoclonal. La spécificité des anticorps monoclonaux est supérieure à celle des sérums polyclonaux, mais leur sensibilité peut être inférieure.

Les modes de révélation de la liaison antigène-anticorps sont nombreux

Il existe de nombreuses variantes techniques correspondant aux différents modes de révélation de la liaison antigène-anticorps ou à des procédés permettant d'améliorer la qualité des résultats. Parmi ces derniers, l'utilisation d'un anticorps secondaire réagissant avec l'anticorps primaire et/ou le démasquage de sites antigéniques grâce à une digestion par une enzyme protéolytique et/ou le chauffage des lames au four à micro-ondes.


3.4 La lectinohistochimie

La lectinohistochimie (ou lectinocytochimie) repose sur l'utilisation de lectines, protéines d'origine animale, végétale ou bactérienne, capables de reconnaître et de se lier à des copules hydrocarbonées des composants cellulaires, notamment des sucres du cell-coat revêtant les membranes plasmiques. Les lectines sont spécifiques d'un sucre donné.


3.5 L'hybridation in situ

L'hybridation in situ (HIS) détecte et localise des séquences d'ADN ou d'ARN. Elle utilise des sondes d'acides nucléiques qui mettent en évidence et localisent, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques complémentaires de la sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Les sondes utilisées sont le plus souvent de l'ADN, un ARN-messager ou des oligonucléotides synthétiques. Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radio-actifs (« sondes chaudes » : tritium H3, phosphore P32 ou P33, soufre S35). Le marquage des sondes peut également se faire par des produits non radio-actifs (sondes dites « froides »)


3.6 - Les procédés de marquage, de révélation et d'observation

Qu'il s'agisse de l'anticorps utilisé en immunohistochimie, de la lectine utilisée en lectinohistochimie ou de la sonde utilisée en hybridation in situ, les procédés de marquage et de révélation sont analogues.

Il s'agit de coupler (conjuguer) l'anticorps, la lectine ou la sonde avec :

soit un fluorochrome (c'est à dire un produit fluorescent, comme la fluorescéine ou la rhodamine) que l'on visualisera par l'observation au MO à lumière ultra-violette ou au microscope confocal.

soit une enzyme (comme la peroxydase du raifort ou la phosphatase alcaline) que l'on fait agir sur son substrat ; le produit de la réaction enzymatique est révélé par un chromogène qui le colore et que l'on peut observer en MO. La sensibilité et la fiabilité des techniques immunohistochimiques utilisant les marquages par une enzyme (méthodes dites immuno-enzymatiques) ont été améliorées par plusieurs méthodes d'amplification du signal. Les méthodes immuno-enzymatiques peuvent être réalisées sur des coupes de tissus congelés ou surtout sur du matériel fixé dans le formol et inclus en paraffine.

soit des billes d'or colloïdal repérables ensuite en ME ; l'utilisation de billes de diamètres différents permet des marquages multiples.

soit de la biotine, vitamine hydrosoluble qui se lie à l'avidine ou streptavidine (protéine bactérienne), par une liaison de haute affinité et de grande spécificité. Le système biotine-avidine est à son tour marqué et révélé par un des procédés précédents (fluorochrome, enzyme ou billes d'or). On peut également localiser la biotine en utilisant des anticorps anti-biotine couplés comme précédemment à un fluorochrome, une enzyme ou de l'or colloïdal.

soit de la digoxigénine, détectée par des anticorps anti-digoxigénine couplés, selon la formule précédente, à un système de révélation.

En associant différentes techniques d'immunohistochimie et/ou d'HIS, utilisant des moyens de marquage et de révélation différents, des signaux multiples peuvent être localisés simultanément dans la même cellule. Ces marquages multiples sont possibles en MO et/ou en ME. Ils bénéficient grandement de la microscopie confocale.


5 L'interprétation des images vise à leur donner du sens

Il ne suffit pas d'observer les images produites par les microscopes, encore faut-il les interpréter. L'interprétation donne une signification aux images observées, détecte la présence d'une structure, d'une molécule, d'une fonction chimique et permet de les localiser dans la cellule, le tissu, l'organe ou l'organisme. L'interprétation est basée sur des processus de reconnaissance de formes, de contrastes, de couleurs, souvent combinés de façon peu dissociable dans des processus de reconnaissance plus globale de « formules », de « patrons ».


5.1 Les incidences de coupe

Les images observées sont situées dans un plan ; elles font partie d'un monde imaginaire à deux dimensions, à partir duquel il faut restituer le monde réel à trois dimensions. Dans certains cas, on oriente le bloc par rapport au plan de coupe, mais le plus souvent les structures sont coupées selon une incidence due au hasard.


5.2 Les artéfacts

Il faut se méfier des artéfacts, images artificielles créées par la technique. Dans une préparation histologique de routine, il peut exister des artéfacts de prélèvement (pinces, ciseaux, coagulation, gelures), de fixation (dessèchement, retard de fixation, fixateur trop ou trop peu concentré), d'inclusion (vides artificiels dus à la rétraction des cellules ou des tissus), de coupe (stries de rasoir, coupes trop épaisses ou trop minces), de collage (décollements, plis et replis de la coupe), de montage (bulles d'air entre la lame et la lamelle) ou de coloration (empâtements, dépôts, taches de colorant).


5.3 Les déformations des images

Dues à des imperfections des moyens optiques d'observation, comme les aberrations de sphéricité ou les aberrations chromatiques, les déformations des images peuvent être rapprochées des artéfacts.


5.4 La mauvaise préservation des tissus

La mauvaise préservation des tissus est fréquente en histologie humaine, qu'il s'agisse de prélèvements biopsiques ou per-opératoires (retard de fixation, tissus situés à proximité de zones pathologiques) ou surtout de prélèvements post-mortem (autopsies tardives).


 

 
Accueil >> DES d'ORL >> Autres cours >> Matériel et méthodes de l'histologie médicale
Joomla 1.5 Templates by JoomlaShine.com